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Il cardinale raccolse per la sua biblioteca un largo numero di codici greci, latini, volgari e nelle diverse lingue orientali. In essi si comprendono i fondi preziosi derivanti da istituzioni religiose come il monastero benedettino di Bobbio, il convento agostiniano di Santa Maria Incoronata e la biblioteca del Capitolo Metropolitano di Milano; così pure quelli provenienti da importanti collezioni private come quella di Gian Vincenzo Pinelli, Francesco Ciceri e Cesare Rovida, illustri studiosi e bibliofili del ‘500. Inoltre furono innumerevoli i donatori che arricchirono in seguito l’Ambrosiana. Ebbe illustri bibliotecari quali lo storico milanese Giuseppe Ripamonti, Ludovico Antonio Muratori, Giuseppe Antonio Sassi, il cardinale Angelo Mai, Antonio Maria Mercati e Achille Ratti divenuto pontefice con il nome di Pio XI.

Per la vastità delle raccolte e per il numero e il pregio dei codici, l’Ambrosiana è indubbiamente una delle prime biblioteche italiane e del mondo. La Biblioteca ha carattere storico, letterario, religioso, particolarmente classico volto allo studio del passato; è retta da due Collegi, uno dei Dottori - presieduto dal Prefetto - che sovraintende alla sua attività culturale, e l’altro dei Conservatori, preposto alla sua amministrazione.

Fra le ricchissime collezioni ambrosiane si ricordano il fondo arabo e orientale; la biblioteca glottologica-dialettale di Carlo Salvioni e la raccolta araldica di Eugenio Casanova. Si contano numerosi palinsesti (con pezzi pregevolissimi come gli unici frammenti superstiti della Vidularia di Plauto, risalenti al V secolo, e parte della versione gotica del Vangelo compiuta dal vescovo ariano Ulfila) e molti manoscritti splendidamente miniati come il Libro d’ore Borromeo, di Cristoforo De Predis, o il Gellio decorato e firmato da Guglielmo Giraldi. Ma sopra tutti eccellono l’Ilias picta del V sec., il famoso Virgilio con annotazioni marginali di Francesco Petrarca, miniato da Simone Martini, il Giuseppe Flavio, nella versione latina, su papiro, il codice irlandese e quello provenzale. Vi sono poi diversi codici autografi come il De prospectiva pingendi di Piero della Francesca, l’Aristotele con il commento trascritto dal Boccaccio, la Vita di Guidobaldo di Montefeltro di mano di Pietro Bembo e gli autografi di S. Tomaso d’Aquino, dell’Ariosto, del Machiavelli, del Tasso, di Galileo per arrivare all’intero fondo pariniano e di Cesare Beccaria. Pregevolissimi, poi, sono molti degli incunaboli (da non dimenticare la rara edizione del Decamerone di Cristoforo Valdarfer, Venezia 1471) e le non poche edizioni principi. La Biblioteca inoltre possiede molte legature di pregio di manoscritti come di stampati, di cui una addirittura in pelle umana. Fra le collezioni speciali sono infine da segnalare quelle degli statuti, delle edizioni aldine, cominiane e bodoniane, nonché la ricchissima collezione delle incisioni e delle stampe di circa 12.000 unità.

La Biblioteca è aperta dal Lunedì al Venerdì con orario continuato dalle 9.30 alle 17.00 e la distribuzione del materiale richiesto è garantita dalle 9.30 alle 11.45 e dalle 14.00 alle 16.30.